日本生研单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测

【摘要】  单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，单增李斯特菌），是李斯特菌属（Listeria）中最重要的人类食源性病原菌〔1〕。目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，该方法费时费力〔2,3〕。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术〔4〕。近年来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。

【关键词】  单增李斯特菌 免疫 胶体金试纸条快速检测

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，单增李斯特菌），是李斯特菌属（Listeria）中最重要的人类食源性病原菌〔1〕。目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，该方法费时费力〔2,3〕。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术〔4〕。近年来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　（1）菌株：单增李斯特菌5株；鼠疫菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O157∶H 7、假结核耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌各1株（分别由军事医学科学院流行病研究所和中国检验检疫科学研究院卫检所提供）。（2）试剂：脑心浸液(BHI)、营养琼脂培养基；NC膜；玻璃纤维、吸水滤纸；氯金酸；其余试剂均由军事医学科学院药品器材供应站提供。（3）主要仪器：隔流喷金划线机；切膜机、压壳机、划线机；ND-1000超微量蛋白定量仪；超纯水发生器；高速冷冻离心机。

　　1.2  方法

　　1.2.1  单增李斯特菌抗体与胶体金制备

　　单增李斯特菌多克隆抗体为本实验室制备。采用柠檬酸钠还原法〔5〕制备25 nm的胶体金。

　　1.2.2  胶体金标记抗体最佳条件测定

　　（1）最佳pH值：采用文献〔6〕方法。（2）最佳标金量：采用试管观察法〔7〕。

　　1.2.3  胶体金探针的制备

　　采用文献〔8,9〕方法。

　　1.2.4  抗体最佳包被浓度和封闭浓度确定

　　用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)把单增李斯特菌抗体稀释为4.0，3.0，2.0，1.5，1.0，0.5 mg/mL的抗体，而且每个浓度的抗体均含有2.0%，1.5%，1.0%，0.75%，0.5%小牛血清(BSA)的各1管。取稀释好的单增李斯特菌抗体（T带）和羊抗兔抗体（C带）用隔流喷金划线机在NC膜上划线，置于37℃干燥2h。然后进行检测。

    1.2.5  胶体金试纸条的组装和检测结果判读

　　胶体金试纸条由样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分组成。将其组装好后用切条机切割成4 mm/条后进行检测。加样10 min后，检测带和质控带均出现红色的为阳性，只有质控带出现红色的为阴性，检测带和质控带均不显色则试纸条无效。

　　1.2.6  胶体金试纸条性能试验

　　（1）敏感性试验：脑心浸液(BHI)培养基37℃培养18 h的单增李斯特菌，4℃ 8 000 r/min离心10 min，再以PBS稀释成不同数量级的菌悬液，涂布血平板进行菌落记数，同时进行检测。 （2）试纸条的特异性试验：单增李斯特菌用BHI培养基培养，其余菌株用溶菌肉汤(LB)培养基培养，4℃ 8 000 r/min离心10 min，再用含1％土温20（Tween-20）的PBS样品稀释液制成菌悬液，进行检测。（3）试纸条的稳定性试验：将胶体金免疫层析试纸条于37℃存放，并分别在3，4，5，6，7 d时取单增李斯特菌悬液（浓度为106 CFU/ml）、小牛血清(浓度为1 mg/ml)和金黄色葡萄球菌（浓度为109 CFU/ml）进行检测，并与同样的PBS溶液做为样品空白对照。

　　1.2.7  检测模拟污染样品

　　火腿肠50 mg、奶粉50 mg、牛奶250 μl和人血清100 μl，分别加入到1 ml含单增李斯特菌的样品稀释液中，混匀，静置10 min或短暂离心（8 000 r/min,15 s），再取1份培养后的菌液，用PBS 10倍系列稀释进行检测。

　　2  结  果

　　2.1  胶体金标记抗体最佳条件

　　2.1.1  pH值

　　pH≤7.5各管中溶液颜色呈不同程度的蓝色,pH≥7.5,各管中溶液颜色无变化，离心后pH≤8.0,的标记管中沉淀不能完全溶解，pH≥8.5的标记管中沉淀完全溶解，溶液呈透明紫红色。因此，胶体金标记的最佳pH值为8.5。

　　2.1.2  最佳标金量

　　静置后观察，含抗体量少的管呈现出由红变蓝的聚沉现象，而加入抗体达到或超过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。使红色保持不变的抗体含量最低的试管的抗体量就是抗体的最适保护量，在此基础上增加20％为稳定胶体金的抗体最佳标金量。当抗体加入量低于12 μg/ml的各管颜色均变蓝，都发生了不同程度的聚沉。所以抗体的最佳标金量为15 μg/ml。

2.2  抗体最佳包被浓度和封闭浓度

　　用不同浓度的单增李斯特菌的菌悬液检测不同包被浓度和封闭浓度的试纸条，结果可见，能检出106 CFU/ml单增李斯特菌的最低包被浓度为1.0 mg/ml，BSA最高封闭浓度为2.0%。空白对照结果显示，包被浓度过高和封闭浓度过低会产生假阳性。所以，考虑到储存和运输对试纸条的影响，选定最佳包被浓度为2.0 mg/ml,封闭浓度为1.0%。

　　2.3  敏感性试验 

优化检测带、质控带抗体浓度和胶体金探针浓度以及层析条的层析特性后,从1.0×109 CFU/ml单增李斯特菌样本10倍系列稀释，不含单增李斯特菌的样品液为空白对照。结果可见，免疫层析条检测灵敏度为1.0×106CFU/ml（图1）。

　　2.4  特异性试验

　　以样品稀释液同样分别处理金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌O157：H7、鼠伤寒沙门菌，阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、表面葡萄球菌、鼠疫菌、假结核耶尔森菌至1×107 CFU/ml，以制备好的胶体金免疫层析试纸条检测，并与同样菌数的单增李斯特菌样品对照，同时检测空白对照。结果可见，该检测试纸条对于这些球菌或杆菌均无非特异现象出现（图2）。

　　2.5  稳定性试验(图3)

　　取在37℃放置的单增李斯特菌胶体金检测试纸条进行检测，第7 d的检测结果可见单增李斯特菌测试条的稳定性良好，在37℃放置7 d后仍能特异性的检出单增李斯特菌，而且敏感性也没有下降。

　　2.6  模拟污染样品试验

　　试纸条检测模拟污染样品试验的结果表明，该试纸条检测食品中模拟污染的单增李斯特菌仍然能检测到106 CFU/ml，而血清由于其组分和粘稠度等的原因对检测的灵敏性有一定的影响，但还能检测到107 CFU/ml。

　　3  讨  论

    单增李斯特菌在美国被列为7种主要的食源性致死病菌之一〔10〕,WHO食品安全工作计划已将其列为重点检测的食源性病菌之一〔11，12〕。我国2008年即将迎来的奥运会并将大量消耗牛奶等即食食品，而这些即食食品很容易被单增李斯特菌污染，这就要求及时对即食食品批量的快速检测。本研制适用于现场快速检测的双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。该试纸条的标记物和被标记抗体通过静电引力和疏水作用结合，因而不会影响抗体活性〔11,12〕。胶体金本身具有肉眼可见的颜色，无需仪器即可判读结果。无需洗涤，不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离，既简化了操作步骤，又减少了影响实验结果的干扰因素〔11〕。该法通常能在5～10 min完成检测，样品处理方法简便、操作灵活、运输方便、不需要其他辅助仪器，结果可直观判断，而且试纸条自带质量控制线，实验结果一目了然，为现场检测提供最佳检测法，尤其是对被单增李斯特菌污染的即食食品的检测，具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点，有利于对单增李斯特菌引起的食物中毒的及时诊断。因此，该试纸条具有广阔应用前景。